- Внеклеточная РНК в жидкостях организма
- Экспорт РНК, Упаковка и Поглощение
- Методы, используемые при изучении РНК в кровообращении
- Экзогенная РНК в кровообращении
- Заявление о конфликте интересов
Координация деятельности различных клеток в организме жизненно важна для многоклеточных организмов. Для этой цели были разработаны по меньшей мере три различных типа систем межклеточной связи. Физические взаимодействия между клетками посредством взаимодействия белков клеточной поверхности, такие как взаимодействие между рецепторами и лигандами, используются для передачи сигналов между близкими, контактирующими клетками ( Шёнбек и Либби, 2001 ; Чиллакури и др., 2012 ). Разрывные соединения могут также способствовать передаче молекулярных сигналов между клетками ( Валиунас и др., 2005 ; Wolvetang и др., 2007 ; Лим и др., 2011 ). Мембранные нанотрубки или цитонемы длиной до 100 мкм представляют собой физические соединения, которые также обеспечивают связь между клетками, которые не находятся непосредственно рядом друг с другом ( Гердес и Карвалью, 2008 ). Многоклеточные организмы также создали сеть циркулирующих биологических жидкостей для доставки питательных веществ в клетки, удаления молекул отходов и передачи сигналов для «межстороннего» обмена данными между клетками и органами. Комбинация системы кровообращения с центральной и периферической нейронными сетями и другими коммуникационными процессами ближнего и среднего радиуса действия позволяет клеткам и органам в организме работать в тесном взаимодействии. Некоторые циркулирующие белки или пептиды хорошо известны своей ролью сигнальных молекул. К ним относятся гормоны, такие как инсулин, гормон роста, пролактин и многие другие секретируемые белки / пептиды. В дополнение к этим хорошо известным примерам другие биомолекулы, такие как нуклеиновые кислоты, также экспортируются из клеток и присутствуют в различных жидкостях организма ( Валади и др., 2007 ; Вебер и др., 2010 ), хотя их потенциальная роль в межклеточной передаче сигналов не подтверждена. Хотя открытие циркулирующей внеклеточной нуклеиновой кислоты не является новым, оно было описано еще в 1948 году ( Мандель и Метай, 1948 ), был возобновлен интерес к функции и применению циркулирующих нуклеиновых кислот из-за нескольких, разнообразных недавних открытий. К ним относятся открытия ДНК плода в материнской крови ( Ло и Чиу, 2012 ) опухолевая ДНК в кровотоке ( Колер и др., 2011 ) и стабильная регуляторная некодирующая РНК (нкРНК) в жидкостях организма ( Кортес и др., 2011 ).
Обычно считается, что РНК является нестабильной молекулой, которая подвержена деградации и обмену в результате повсеместной активности РНКазы. Однако интактные РНК разных типов, в том числе белок-кодирующая РНК (мРНК) и некодирующая РНК (нкРНК), были обнаружены в кровотоке ( Валади и др., 2007 ). Некоторые из этих РНК, вероятно, являются результатом лизиса клеток посредством нормального клеточного обмена и находятся в процессе деградации, реабсорбции или выведения ( Турчинович и др., 2011 ). Тем не менее, изобилие и высокая стабильность некоторых из этих молекул РНК, особенно короткой регуляторной РНК, микроРНК (miRNA), предлагает другой сценарий: возможность системы межклеточной связи через сигналы, опосредованные РНК ( Лотвалл и Валади, 2007 ; Турчинович и др., 2011 ; Монтекальво и др., 2012 ). Кроме того, недавние исследования показали, что молекулы экзогенной РНК могут поступать в кровообращение с помощью диеты или другими способами, и могут потенциально поглощаться клетками и тем самым изменять клеточный транскриптом ( Семенов и др., 2012 ; Ван и др., 2012 ; Чжан и др., 2012а ). Однако многие вопросы остаются без ответа, в том числе: каковы источники эндогенных и экзогенных молекул РНК, находящихся в обращении, каков механизм (ы), посредством которого эти РНК попадают в циркуляцию, как они там стабилизируются, принимаются ли они клетками, и как они распознаются для поглощения клетками? Здесь мы рассмотрим несколько последних событий в изучении циркулирующих РНК и их потенциальных функций и возможных приложений.
Внеклеточная РНК в жидкостях организма
Среди всех циркулирующих нуклеиновых кислот микроРНК, вероятно, наиболее изучены. Эти небольшие молекулы являются короткими, нкРНК участвуют в регуляции клеточного транскриптома и протеома путем дестабилизации мРНК и / или ослабления трансляции белка ( Филипович и др., 2008 ; Фабиан и др., 2010 ). Взаимодействие между миРНК и их родственными мишенями мРНК обеспечивается частичной комплементарностью последовательностей между ними ( Фабиан и др., 2010 ). РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC), который содержит ряд белков, включая членов семейства Argonaute, мотив распознавания РНК, содержащий белок TNRC6B, предполагаемую ДНК-геликазу MOV10, среди прочего, участвует во взаимодействии miRNA-мРНК ( Чендримада и др., 2007 ).
МикроРНК были впервые обнаружены в плазме крови и сыворотке крови в 2008 году ( Чен и др., 2008 ; Чим и др., 2008 ; Хантер и др., 2008 ; Лори и др., 2008 ; Митчелл и др., 2008 ; Ског и др., 2008 ) и впоследствии были обнаружены во многих других жидкостях организма, включая мочу, слюну, слезы и грудное молоко ( Парк и др., 2009 ; Ханке и др., 2010 ; Вебер и др., 2010 ). Общее количество и концентрация отдельных микроРНК широко варьируются в зависимости от типа жидкости ( Вебер и др., 2010 ). Потенциал циркулирующих микроРНК как биомаркеров в последние годы интенсивно исследовался. miRNAs делают хороших кандидатов биомаркеров по нескольким причинам. Они стабильны в жидкостях организма, которые легко получить у пациентов, их можно легко измерить с высокой чувствительностью, поскольку они являются амплифицируемыми, а некоторые маркеры и наборы маркеров показали профили, связанные с конкретными патологиями. Изменения в уровнях микроРНК могут быть использованы в качестве диагностического инструмента для нескольких типов рака ( Митчелл и др., 2008 ; Тейлор и Герсель-Тейлор, 2008 ; Парк и др., 2009 ; Ханке и др., 2010 ; Хуан и др., 2010 ; Чжао и др., 2010 ; Муссей и др., 2011 ; Рот и др., 2011 ), повреждение сердца ( Ай и др., 2010 ; Корстен и др., 2010 ; Tijsen et al., 2010 ; Ван и др., 2010а ), мышечные травмы и патологии ( Латерца и др., 2009 ; Мидзуно и др., 2011 ; Виньер и др., 2013 ), сахарный диабет ( Чен и др., 2008 ; Эренер и др., 2013 ), повреждение печени ( Латерца и др., 2009 ; Ван и др., 2009 , 2013 ; Старки Льюис и др., 2011 ), среди прочих.
За последние несколько лет литература, сообщающая о корреляциях с болезнями и патологиями человека, быстро росла. Число работ, например, об изменениях циркулирующих микроРНК в случаях только инфаркта миокарда (ИМ) и сердечных заболеваний, резко возросло. По нашим оценкам, с 2009 года было опубликовано более 30 отчетов только по этой конкретной теме. Некоторые циркулирующие микроРНК, выявленные при ИМ и сердечных заболеваниях, приведены в таблице. 1 ,
ТАБЛИЦА 1. Циркулирующие микроРНК с биомаркерным потенциалом для диагностики острого инфаркта миокарда (ОИМ).
Также были предприняты попытки использовать циркулирующие микроРНК в качестве прогностического инструмента в ответ на терапевтическое лечение ( Ма и др., 2012 ). Кроме того, была рассмотрена возможность использования микроРНК в качестве терапевтических средств. Это очень захватывающая перспектива, если эти молекулы могут быть упакованы и выпущены в обращение в виде стабильных и, возможно, даже целевых упаковок. Приложения в этой области используют разные подходы. Например, создание синтетических микроРНК, предназначенных для нацеливания на определенные связанные с болезнью гены, как используется Suckau et al. (2009) лечить сердечную недостаточность. В этом случае вирусные векторы, содержащие короткие РНК-шпильки, вводили крысам внутривенно для снижения уровня основного регулятора сердечного кальциевого гомеостаза, фосфоламбана ( Suckau et al., 2009 ). Также было продемонстрировано использование антагомиров для нацеливания на миРНК, которые активируются при патологических состояниях. Например, антагомир miR-133 вызывал длительную гипертрофию сердца у мышей ( Уход и др., 2007 ); антагомиры, нацеленные на miR-1 и let-7f, были успешно использованы у крыс для продления нейропротекции после ишемического инсульта ( Сельвамани и др., 2012 ); у мышей, получавших высокие дозы антагомира для miR-126, наблюдался сниженный ангиогенез, вызванный ишемией ( Ван Золинген и др., 2009 ); и антагомир miR-206 увеличивал уровни нейротрофического фактора в мозге и улучшал функцию памяти у крыс с болезнью Альцгеймера ( Ли и др., 2012 ). Кроме того, лечение хронической инфекции вирусом гепатита С (HCV) с использованием антагомира для специфичного для печени miR-122 в настоящее время находится в клиническом испытании ( Янссен и др., 2013 ).
Экспорт РНК, Упаковка и Поглощение
В то время как внеклеточные РНК сначала считались молекулярным мусором, высвобождаемым в результате лизиса клеток ( Турчинович и др., 2011 ), различие в спектре РНК в культивируемых клетках и внешней среде убедительно свидетельствует о селективном экспорте некоторой фракции циркулирующих РНК ( Ван и др., 2010b ). Остается неясным, как специфические РНК предназначены для экспорта, и если некоторые из них просто высвобождаются с цитозолем в результате массового экзоцитоза. Поскольку свободные молекулы РНК, вероятно, будут разлагаться вне клетки, обычно предполагается, что циркулирующие РНК упакованы в некоторой форме, чтобы избежать деградации РНКазы. Липидные везикулы, такие как экзосомы или микровезикулы, представляют собой один тип упаковочной системы, используемый секретируемыми РНК ( Валади и др., 2007 ; Камусси и др., 2011 ). Экзосомы диаметром около 30–100 нм образуются путем слияния мультивезикулярных тел с плазматической мембраной. Микровезикулы имеют больший размер (100 нм – 1 мкм) и образуются при пузырьковании плазматической мембраны. Оба типа везикул могут содержать ряд молекул белка и РНК, хотя состав широко варьируется в зависимости от происхождения везикулы ( Мюллер, 2012 ; Хуан и др., 2013 ).
В дополнение к липидным везикулам было продемонстрировано, что miRNA во внеклеточной среде может образовывать комплексы с липопротеинами высокой плотности (HDL) и по меньшей мере двумя РНК-связывающими белками in vivo , Argonaute 1 (AGO1) и Argonaute 2 (AGO2), и с нуклеофосмином 1 (NPM1) in vitro ( Ван и др., 2010b ; Арройо и др., 2011 ; Турчинович и др., 2011 ; Викерс и др., 2011 ; Турчинович и Бурвинкель, 2012 ; Вагнер и др., 2013 ). Кроме того, спектр микроРНК, связанной с ЛПВП, зависит от состояния здоровья человека ( Викерс и др., 2011 ). Однако неизвестно, существуют ли другие РНК-связывающие белки, которые образуют аналогичные комплексы для защиты микроРНК или других типов РНК в циркуляции.
Помимо miRNAs липидные везикулы также содержат большое количество кодирующих белок РНК. Примерно 1300 различных транскриптов мРНК были идентифицированы в липидных везикулах, полученных из линий клеток человека или мыши ( Валади и др., 2007 ). Интересно, что состав и содержание мРНК в экзосомах отличаются от состава исходной клетки, что предполагает, что содержимое липидных везикул избирательно упаковано, а не включено без разбора. Было показано, что уровни циркулирующих микроРНК, а также нескольких мРНК в кровотоке связаны со стадиями и типами рака ( Суэока и др., 2005 ; Митчелл и др., 2008 ; Тейлор и Герсель-Тейлор, 2008 ; Охшима и др., 2010 ; Чжао и др., 2010 ; Чжан и др., 2012b ), беременность ( Zhong et al., 2008 ; Раджакумар и др., 2012 ; Ву и др., 2012 ; Чжао и др., 2012 ; Higashijima et al., 2013 ) и лекарственное повреждение печени ( Миямото и др., 2008 ; Латерца и др., 2009 ; Ван и др., 2009 , 2013 ; Бала и др., 2012 ; Су и др., 2012 ; Окубо и др., 2013 ).
Идея использования РНК в качестве способа межклеточной коммуникации особенно интересна по нескольким причинам. Во-первых, РНК может передавать информацию простым и эффективным способом (таким как кодирование белков в мРНК), и, во-вторых, она может координировать клеточную активность фундаментальным и важным способом (таким как микроРНК-опосредованная транскриптома и регуляция протеома). Было продемонстрировано, что клетки могут экспортировать микроРНК, которые могут быть перенесены в клетки-реципиенты и функционируют в них ( Косака и др., 2010 ; Чжан и др., 2010 ; Hergenreider et al., 2012 ). Тем не менее, по своей природе сложно окончательно протестировать функционирование системы связи на основе РНК in vivo . Эксперименты по условному обмену средами и совместному культивированию использовались для изучения межклеточной коммуникации, и эти методы были адаптированы для изучения возможности поглощения РНК клетками ( Лю и др., 2010 ; Vencio et al., 2011 ; Ян и др., 2011 ). Было показано, что некоторые мРНК, происходящие из экзосом, функционируют в клетках реципиента ( Валади и др., 2007 ; Исмаил и др., 2013 ). Более того, Ратайчак и др. (2006) показали, что микровезикулы, полученные из эмбриональных стволовых клеток, могут повысить выживаемость и размножение гематопоэтических клеток-предшественников мыши и обогащены транскриптами, связанными со стволовыми клетками, включая Oct-4, Rex-1, Nanog, SCL и GATA-2. Репортерные анализы показали, что происходящие из экзосом miRNAs могут молчать транскрипты в клетках реципиента ( Лотвалл и Валади, 2007 ; Валади и др., 2007 ; Камусси и др., 2011 ; Когуре и др., 2011 ; Миттельбрунн и др., 2011 ). Хотя данные свидетельствуют о том, что культивируемые клетки могут переносить упакованные молекулы РНК, трудно продемонстрировать это как общий механизм in vivo . Один из наиболее важных оставшихся биохимических вопросов заключается в том, как РНК, находящаяся в обращении, защищена, упакована, доставлена и признана их целями. Нынешнее отсутствие знаний по этим вопросам делает изучение биологических функций циркулирующей РНК как важным, так и трудным.
Помимо кодирующих белок РНК и miRNAs, существуют другие более распространенные типы регуляторных молекул РНК, такие как крупные межгенные нкРНК (lincRNAs) и небольшие нуклеолярные РНК (snoRNAs) во внеклеточных везикулах ( Хуан и др., 2013 ). Недавняя характеристика нейрональных экзосом обнаружила РНК, полученные из повторных последовательностей, а также мРНК и несколько типов малых РНК. Хотя большая часть малых РНК была тРНК (90%), были также обнаружены другие типы малых РНК, включая miRNA, snoRNA и малую цитоплазматическую РНК (scRNA) ( Беллингхем и др., 2012 ). Поскольку и мРНК, и микроРНК могут быть поглощены и использованы клетками (см. Предыдущий абзац), нет никаких оснований полагать, что другие типы РНК в кровотоке также не имеют функциональных последствий, когда они поглощаются клетками. Однако в настоящее время нет прямых экспериментальных данных, подтверждающих эту функциональную возможность для других типов РНК в кровообращении.
Методы, используемые при изучении РНК в кровообращении
Микрочипы, КПЦР (количественная полимеразная цепная реакция) и подходы, основанные на секвенировании, являются тремя основными платформами, которые были использованы для профилирования микроРНК и мРНК. Все это широко и успешно применяется при оценке спектров мРНК и микроРНК в клетках и тканях. Однако из-за относительно низкой концентрации РНК, присутствующей в кровообращении, комплексное измерение любой циркулирующей РНК трудно сделать точно и последовательно. Для микроРНК трудности усугубляются короткими длинами молекул РНК и последующей специфичностью последовательностей свободных энергий гибридизации. В настоящее время наиболее часто используемым методом для профилей miRNA является qPCR из-за его чувствительности и ограниченного количества известных miRNAs (порядка 1000 последовательностей). Этот метод также имеет существенные недостатки из-за специфичности и эффективности дифференциальной амплификации разработанных праймеров. Этот метод также был применен для измерения уровня определенных последовательностей мРНК в кровотоке ( Ван и др., 2013 ). Хотя микроматрицы были золотым стандартом для анализа транскриптома в клетках и тканях, низкая концентрация РНК в кровообращении и сходство последовательностей этих коротких молекул нуклеиновых кислот делают анализ микрочипов непригодным в большинстве случаев. Разработка секвенирования следующего поколения (NGS) показала перспективность измерения циркулирующих РНК. Эта платформа не только решает некоторые проблемы измерения miRNA, связанные с короткими и очень похожими последовательностями miRNAs, но и может обеспечить измерения широкого спектра РНК в одном эксперименте. Поскольку он не зависит от предварительно разработанных зондов или праймеров, NGS также позволяет идентифицировать новые последовательности РНК, такие как изомиры и экзогенные РНК в циркуляции ( Ли и др., 2010 ; Ван и др., 2010а , 2012 ; Семенов и др., 2012 ). Одной из сложностей этого метода является пристрастность при подготовке библиотек секвенирования. По этой причине абсолютные измерения циркулирующей РНК очень трудны, но при тщательном проведении сравнительные измерения могут быть надежными.
Экзогенная РНК в кровообращении
Последние данные, которые мы обсудим ниже, позволяют предположить, что РНК, находящиеся в обращении, происходят не только из клеток человеческого организма, но также из чужеродных организмов и вирусов ( Meckes et al., 2010 ; Пегтель и др., 2010 ). Было показано, что экзогенные РНК попадают из внешней среды, через диету или из сложного микробиома человека ( Чжан и др., 2012а ). Мало что известно о том, как экзогенные РНК извлекаются кишечным эпителием из окружающей среды, и пока есть только очень ограниченные и косвенные доказательства того, что эти РНК функционируют в организме. Однако в соответствии с существенным и растущим объемом доказательств того, что некоторые циркулирующие РНК человека являются функциональными, возможность того, что экзогенные РНК, обнаруженные в кровообращении, могут быть задействованы и выполнять специфические функции в клетках-реципиентах, поднимает несколько интересных вопросов.
Недавний отчет Чжан и соавт. (2012a) показали, что экзогенные микроРНК, поступающие из пищи (в данном случае рис), могут проникать в кровоток человека и поглощаться клетками и фактически функционировать в клетках. Они обнаружили, что некоторые растительные miRNAs, включая miR-168a, богатую miRNA в рисе, обнаруживаются в плазме человека, а также в плазме других животных, питающихся рационом, содержащим растительный материал. Тем не менее, многие вопросы, такие как то, как РНК выживает в процессе приготовления пищи и суровые условия пищеварительного тракта, а также как эти биомолекулы могут проходить через эпителий кишечника, остаются в основном без ответа. С использованием клеток Caco-2, трансфицированных синтетическим рисом miR-168a, Чжан и соавт. (2012a) обнаружили, что трансфицированные miR-168a могут упаковываться клетками в микровезикулы и высвобождаться в культуральную среду. Кроме того, их работа предполагает, что микровезикулы, содержащие экзогенную микроРНК, могут поглощаться клетками и взаимодействовать с эндогенными транскриптами как in vitro, так и in vivo . Зрелая последовательность miR-168a имеет значительную гомологию последовательности с транскриптом, экспрессируемым печенью, транскриптом белка 1 адапторного рецептора липопротеина низкой плотности (LDLRAP1), что повышает вероятность того, что она может подавлять экспрессию LDLRAP1 посредством действия комплекса RISC. Действительно, мыши, которых кормили рисосодержащей диетой, имели более низкий уровень экспрессии гена LDLRAP1, чем мыши, которых кормили нормальной рационом, что предполагает, что miR-168a, полученный из риса, может влиять на уровень транскрипта эндогенной мыши ( Чжан и др., 2012а ).
Недавние работы нашей лаборатории и других систематически характеризовали состав РНК в кровообращении и показали, что некоторые из циркулирующих РНК происходят из различных экзогенных организмов, включая микробиом ( Семенов и др., 2012 ; Ван и др., 2012 , 2013 ). Использование стратегии map-and-remove для анализа небольших данных RNA-seq (после удаления последовательностей, сопоставленных с человеческими miRNAs, транскриптами и геномными последовательностями), показывает, что значительная часть общего числа прочтений имеет нечеловеческое происхождение. Хотя некоторые из этих экзогенных РНК получают из рациона, большинство из них имеют грибковое или бактериальное происхождение ( Ван и др., 2012 ). Обнаруженные последовательности обнаруживают широкий спектр бактериальных типов, в том числе многие, о которых уже известно, что они находятся в кишечном микробиоме. Хотя не было существенных различий в спектрах РНК в плазме между здоровыми людьми и теми, у кого колоректальный рак или язвенный колит, различия могут быть обнаружены в плазме людей, придерживающихся различных диет, таких как диета на основе кукурузы и диета на основе риса ( Ван и др., 2012 ).
Хотя эти результаты открывают интересную возможность того, что экзогенные РНК, взятые из окружающей среды, могут изменять экспрессию генов в клетках организма, многие вопросы остаются без ответа. Например, как эти РНК проходят через барьер эпителиальной оболочки тела и попадают в кровообращение, до сих пор совершенно неясно. Из-за относительно низкого уровня экзогенной циркулирующей РНК представляется вероятным, что, если упаковки, содержащие экзогенные РНК, оказывают значительное биологическое воздействие на клетки организма, они должны быть каким-то образом эффективно направлены на конкретные клетки или ткани.
Так как некоторые микроРНК высоко консервативны у метазойцев ( Ши и др., 2012 ), обнаружение в рационе экзогенной РНК, получаемой из рациона, повышает интересную возможность того, что существуют основанные на РНК процессы, которые либо индуцируют, либо предотвращают развитие заболеваний у людей, возникающих в результате инородной РНК. Например, изменение уровня некоторых высококонсервативных микроРНК, таких как miR-21, который обладает твердой активностью в отношении пролиферации ( Сайед и др., 2008 ; Яо и др., 2009 ) и miR-150 и miR-146, которые имеют сильную связь с активностью воспаления ( Шиди и О'Нил, 2008 ; Сонколи и др., 2008 ; Шмидт и др., 2009 ; Куинн и О'Нил, 2011 ; Zhong et al., 2012 ), поглощение экзогенных РНК с подобными активностями может влиять на возникновение и прогрессирование определенных заболеваний.
Несмотря на то, что они обещают как биомаркеры, так и потенциальные функциональные воздействия, например, в терапевтических целях, многое еще предстоит узнать о РНК в кровотоке. Этот недавно признанный класс циркулирующих молекул может быть глубоко вовлечен в симбиотическое функционирование человеческого организма и его микробиома. В настоящее время мы очень мало знаем о потенциальных механизмах проникновения РНК в циркуляцию, их механизмах действия, процессах их упаковки и экспорта, а также их нацеливании и поглощении клетками. Необходимы технические усовершенствования и стандартизация в измерении уровней этих РНК, а также новых модельных экспериментальных систем, чтобы исследовать многие аспекты транспорта, нацеливания и функции этих РНК. Таким образом, воздействие РНК на здоровье человека, по-видимому, является значительным, но эта область только начинает изучаться, и исследование области количественной характеристики и специфических биологических функций экзогенной РНК еще более раннее в ее развитии.
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
