- Штаммы, плазмиды и бактериальное культивирование Для списка штаммов и плазмид, использованных в этом...
- Подсчет экспериментов in vivo
- Сравнение темпов роста
- Конфокальная микроскопия
- Замедленная микроскопия
- Проточной цитометрии
- Моделирование частоты ошибок
- Моделирование динамики популяции микробиоты
Штаммы, плазмиды и бактериальное культивирование
Для списка штаммов и плазмид, использованных в этом исследовании, см. Дополнительная таблица 2 , Для поддержания плазмиды ампициллин использовали в конечной концентрации 100 мкг мл -1, стрептомицин использовали в конечной концентрации 300 мкг мл -1. Если не указано иное, клетки выращивали в среде LB. Плазмиды (см. Дополнительный Рис. 7 для контрольной плазмидной карты) были построены с использованием ПЦР с Q5 или Phusion полимеразой (New England Biolabs) и сборкой Гибсона (см. Дополнительная таблица 3 список использованных последовательностей праймеров). Для выделения ДНК были использованы наборы QIAprep spin или QuickLyse (Qiagen), а наборы DNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) - для очистки ПЦР. Плазмидные вставки были подтверждены с помощью секвенирования Sanger (Eton Bioscience).
Эксперименты по подсчету in vitro
Клетки E.coli DP10 выращивали в течение ночи в среде LB с добавлением ампициллина и обратно разбавляли 1: 100. Через 1,5–2 ч роста клетки индуцировали в течение 3–4 ч 1 мМ арабинозой, затем один раз промывали 1 × PBS и концентрировали в 10 раз центрифугированием. 1 мл клеток инокулировали в 1 л среды (описанной ниже) во флаконе с турбидостатом. В некоторых экспериментах мы выращивали клетки экспоненциально в среде LB в колбах (встряхивали при 250 об / мин при 37 ° C) и разводили культуры 1: 4 (для DP10) или 1: 8 (для PAS418) в свежей, предварительно нагретой среде LB каждые часы, чтобы поддерживать экспоненциальный рост.
Для мониторинга роста бактерий на протяжении многих поколений мы создали самодельный турбидостат, который мы назвали «Evolvulator». Каждый Evolvulator состоял из микроконтроллера Ethernet, оснащенного специально разработанной дочерней платой, способной подключаться к различным компонентам и управлять ими (см. Дополнительные таблицы 4 а также 5 для списков деталей). Светодиод (LED) и фотодиод были использованы для измерения оптической плотности клеток, выращенных в стеклянной бутылке емкостью 1 л. Поскольку длина бутылки 1 л составляет около 10 см, мы выбрали светодиод, который излучает свет при 527 нм, чтобы минимизировать поглощение света водой. Клетки перемешивали, используя магнитную мешалку внутри бутылки и магнит, установленный на компьютерном вентиляторе; Скорость перемешивания модулировали с помощью потенциометра (POT0) для управления напряжением на вентиляторе посредством широтно-импульсной модуляции. Шасси Evolvulator было изготовлено из лазерной резки 3 мм акрила. Свежая среда подавалась самотеком из 20-литрового бутыли, управляемого электромеханическим пережимным клапаном. Специальное серверное программное обеспечение, написанное на Python и использующее управляемый событиями сетевой механизм Twisted, было разработано для управления обратной связью, работающей на Zotac ZBOX HD-AD02 с установленной Ubuntu 11.10. Веб-интерфейс был разработан с использованием Java и HTML, что позволяет пользователю отслеживать OD в режиме реального времени, а также изменять экспериментальные параметры, такие как целевая OD, отклонения от целевой OD и показания датчика OD. Показания фотодиодов и информация о состоянии клапана были сохранены в базе данных SQL, которая хранится локально на сервере управления. Образцы собирали из флакона с помощью шприца через равные промежутки времени. Доступ ко всему коду сервера и схемам проектирования можно получить в следующем репозитории GitHub: (см. Дополнительное программное обеспечение 1 , https://github.com/Wyss/evolvulator.git ).
Светодиод на каждом устройстве Evolvulator был откалиброван с помощью регулировки потенциометра (POT1) на один фотодиод, чтобы гарантировать, что интенсивность испускаемого света была сопоставима между устройствами. После калибровки светодиода каждый фотодиод для конкретного устройства был откалиброван по собственному спектрофотометру NanoDrop 2000c (Thermo Scientific) для устранения различий между приборами по показаниям оптического диаметра из-за присущих производственных допусков электрических компонентов. В частности, рассчитанные OD Evolvulator были нанесены на график против OD NanoDrop для получения калибровочной кривой ( Дополнительный рис. 2б ). Поскольку отношение Evolvulator OD к NanoDrop OD не было линейным, мы подгоняли полиномиальную линию тренда к данным, которые проходили через начало координат. Полученные в результате коэффициенты, специфичные для устройства, затем использовались для расчета эквивалентных оптических величин NanoDrop из необработанных данных датчика, собранных в ходе данного эксперимента. Мы написали пользовательские скрипты Python и Matlab для извлечения и анализа данных о работе фотодиодных датчиков и клапанов из баз данных, созданных в ходе эксперимента. Время генерации рассчитывали после каждого события разбавления биореактора. Вкратце, коэффициент пропускания% рассчитывали по уравнению (1). Затем был рассчитан эквивалентный OD нанодропа с использованием уравнения (2). Затем наносили на график Ln (OD) и наклон этой экспоненциальной кривой роста извлекали с использованием функции полифита Матлаба. Время генерации затем рассчитывали с использованием уравнения (3).
Уравнения:
C 1 и C 2 в уравнении (2) представляют коэффициенты для конкретного устройства, рассчитанные по калибровке устройства.
Для экспериментов, показанных в Рис. 2б, в , а также Дополнительный Рис. 2c Мы использовали минимальный носитель, содержащий 135,6 г динатрийфосфата, 60 г мононатрийфосфата, 10 г хлорида натрия, 20 г хлорида аммония, 80 г глюкозы (0,4% мас. / об.), 100 г казаминокислот (0,5 % масс. / об.), 202,2 г нитрата калия (конечная концентрация: 100 мМ), на 20 л бутыли. В среду добавляли сульфат магния (конечная концентрация: 1 мМ), гидрохлорид тиамина (конечная концентрация: 1 мкг мл -1) и хлорид кальция (конечная концентрация: 100 мкМ).
Для экспериментов, показанных в Рис. 2d а также Дополнительный рис. 2г использовали соли М9 с добавлением нитрата калия (конечная концентрация: 100 мМ), сульфата магния (конечная концентрация: 1 мМ), гидрохлорида тиамина (конечная концентрация: 1 мкг мл -1) и хлорида кальция (конечная концентрация: 100 мкМ). Мы варьировали источник углерода, смесь аминокислот и температуру. Мы использовали следующие комбинации: глюкоза (0,4% мас. / Об.) И казаминовые кислоты (0,5% мас. / Об.) При 37 ° С, глюкоза (0,4% мас. / Об.) И лейцин (конечная концентрация: 1 мМ) при 37 ° С. глюкоза (0,4% мас. / об.) и лейцин (конечная концентрация 1 мМ) при 23 ° С, глицерин (0,4% мас. / об.) и лейцин (конечная концентрация: 1 мМ) при 23 ° С.
Для экспериментов, показанных в Рис. 4d мы использовали соли М9 с добавлением глюкозы (0,4% мас. / об.), казаминокислот (0,5% мас. / об.), нитрата калия (конечная концентрация: 100 мМ), сульфата магния (конечная концентрация: 1 мМ), гидрохлорида тиамина (конечный концентрация: 1 мкг мл -1) и хлорид кальция (конечная концентрация: 100 мкМ). Клетки выращивали при 37 ° С.
Для экспериментов, показанных в Рис. 4d а также Дополнительный рис. 4б мы использовали соли М9 с добавлением нитрата калия (конечная концентрация: 100 мМ), сульфата магния (конечная концентрация: 1 мМ), гидрохлорида тиамина (конечная концентрация: 1 мкг мл -1) и хлорида кальция (конечная концентрация: 100 мкМ) , Мы варьировали источник углерода, смесь аминокислот и температуру. Мы использовали следующие комбинации: глюкоза (0,4% мас. / Об.) И казаминовые кислоты (0,5% мас. / Об.) При 37 ° С, глюкоза (0,4% мас. / Об.) И лейцин (конечная концентрация: 1 мМ) при 37 ° С. глюконат натрия (0,4% мас. / об.) и лейцин (конечная концентрация: 1 мМ) при 37 ° С.
Для экспериментов, показанных в Дополнительный рис. 2г мы сравнили время удвоения на основе оптической плотности (τOD, рассчитанное, как описано выше) с временем удвоения, основанным на уменьшении доли включенных ячеек (τON, рассчитанное на основе наклона линейной подгонки к log2 из доля включенных ячеек с использованием красных точек данных). Мы наблюдали первоначальную адаптацию к новым условиям роста (более медленное снижение доли «вкл.») В начале каждого временного хода. Мы также наблюдали более медленное снижение доли «вкл.» Ближе к концу каждого временного хода из-за спонтанного рождения частиц или ложных срабатываний. Если после индукции частицы не образуются, мы ожидаем, что две меры удвоения времени будут идентичны, а именно τOD = τON. Тем не менее, производство частиц (через выражение утечки или расщепление частиц) обычно приводит к тому, что τON будет больше, чем τOD. Мы вводим термин α для учета этого производства, который определяется как разница в скоростях роста, рассчитанных по оптической плотности и DCDC, такая, что α + 1 / τON = 1 / τOD. В Дополнительный рис. 2г мы рассчитали α = 1/24.
Подсчет экспериментов in vivo
E.coli PAS133 трансформировали pCAM10A, затем хромосомно интегрированную конструкцию sfGFP переносили посредством трансдукции P1vir из E.coli PAS143, штамма, характеризуемого Brian Chin (Гарвардская медицинская школа; текущая принадлежность, Sysmex Inostics; не опубликовано). Этот новый штамм был назван PAS418.
Самки 10-недельных мышей BALB / c были получены от Charles River Laboratories и им давали акклиматизироваться в течение 1 недели. Перорально вводимая кишечная палочка обычно не будет колонизировать кишечник, если эндогенные бактерии не ингибируются. Поэтому в питьевую воду мышей добавляли 5% сахарозы и 0,5 мг мл -1 стрептомицина для уменьшения эндогенной флоры за 1 день до перорального введения искусственной кишечной палочки. 34 , Инженерные кишечные палочки культивировали в течение ночи в М9 с добавлением 0,4% (мас. / Об.) Глюкозы, 0,5% (мас. / Об.) Казаминокислот и ампициллина. Мы использовали 2% (вес / объем) арабинозы для индукции в течение ночи. Приблизительно 107 сконструированных клеток E.coli из ночной культуры отмывали в PBS и вводили каждой мыши через оральный зонд. Образцы фекалий отбирали каждые два часа, изолируя мышей в стерильных пластиковых контейнерах в течение 3 мин, пока не были получены по меньшей мере три гранулы фекалий. Фекальные шарики суспендировали в 1 мл PBS, разбавляли 1:10 в PBS и центрифугировали при 50 g в течение 20 минут. 600 мкл супернатанта удаляли и хранили при 4 ° С до анализа проточной цитометрией, который выполняли в течение 24 часов после сбора образца. На протяжении всех экспериментов мышей кормили зерновой пищей без арабинозы (ssniff EF R / M Control feed, ssniff-Spezialdiäten GmbH, Soest, Germany) ad libitum. На протяжении наших экспериментов у животных не было никаких признаков боли или стресса. Наш протокол о животных был одобрен Постоянным комитетом Гарвардской медицинской области по животным, протокол 04966.
Сравнение темпов роста
Клетки E. coli DP10 и PAS418 выращивали в течение ночи в среде LB. Клетки PAS418 индуцировали в течение ночи 2% (мас. / Об.) Арабинозы, а клетки DP10 / pCAM10 индуцировали в течение 4 ч 1 мМ арабинозой. Клетки промывали три раза в 1 × PBS, а затем разбавляли 1: 1000 в свежей среде LB. 150 мкл разведенных клеток переносили в 96-луночные микропланшеты (Corning) с верхним слоем 100 мкл минерального масла для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в многолечевом ридере Perkin Elmer Victor 3 V 1420 при 37 ° C и встряхивание среды проводили в течение 8 часов, а оптическую плотность при 600 нм регистрировали каждые 5 минут.
Конфокальная микроскопия
Клетки E. coli получали с использованием моторизованного инвертированного микроскопа Nikon Ti, снабженного объективом 100 × Plan Apo NA 1.4, в сочетании с вращающимся диском Yokagawa CSU-X1, конфокальным с модификацией Spectral Applied Research Aurora Borealis. Для получения изображений mRFP1 - твердотельный лазер мощностью 100 мВт с длиной волны 561 нм с четырехпроходным дихроичным зеркалом (Chroma) и эмиссионным фильтром 620/60 (Chroma # 858). Для визуализации GFP использовался твердотельный лазер 488 нм с четырехпроходным дихроичным зеркалом (Chroma) и эмиссионным фильтром 525/50 (Chroma # 852). Получение изображений осуществлялось с помощью камеры с охлаждаемым зарядным устройством Hamamatsu ORCA-AG. Метаморф программное обеспечение было использовано для получения изображений. Для z- стеков было получено семь оптических сечений с интервалом 0,5 мкм, которые отображаются как максимальные z- проекции. Яркость и контраст были настроены равномерно с использованием ImageJ версии 1.48. Эти изображения показаны в Рис 1 а также 4 , Дополнительные рисунки 1 а также 4
Замедленная микроскопия
Образцы помещали в чашку MatTek, покрытую 2% агарозной подушкой, содержащей среду М9 с добавлением 0,4% (вес / объем) глюкозы и 0,5% (вес / объем) казаминокислот. Низкую плотность клеток использовали для образования хорошо разделенных микроколоний. Промежуточные изображения были получены с использованием микроскопа Nikon TE-2000 с фазовым объективом с числовой апертурой 100 × 1,4 и камерой с зарядовой связью ORCA-ER (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Япония). Освещение обеспечивалось люминесцентным светодиодным осветителем Lumencor. NIS-Elements AR версия 4.20.00 использовалась для управления микроскопом и камерой во время съемки. В общем, мы получали кадры каждые 5 минут, используя не более 50% максимальной мощности на Lumencor, чтобы минимизировать эффекты фотообесцвечивания. Эти изображения показаны в Рис. 3 ,
Проточной цитометрии
Клетки E.coli анализировали с использованием проточного цитометра BD LSRII с высокопроизводительным пробоотборником. Для обнаружения mRFP1 использовали лазер 594 нм и фильтр 630/22. Для обнаружения GFP использовался лазер 488 нм и фильтр 525/50. Клетки были закрыты путем прямого и бокового рассеяния, чтобы исключить дублеты. Образцы запускались со скоростью ≤2000 событий в секунду, чтобы обеспечить точное обнаружение. При необходимости клетки концентрировали центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут и полученный осадок ресуспендировали в меньшем объеме. Для экспериментов in vitro, показанных в Рис. 2 трубы были использованы; высокопроизводительный пробоотборник использовался в других экспериментах. Контрольные эксперименты проводились с чередующимися светлыми и темными лунками, чтобы обеспечить минимальный перенос между лунками. Данные проточной цитометрии были проанализированы с использованием FlowJo v. 10.6 или пользовательских сценариев MATLAB (Mathworks, Natick, MA; Дополнительное программное обеспечение 2 ).
Моделирование частоты ошибок
Мы построили математическую модель, чтобы лучше понять влияние деградации частиц, расщепления или ложного образования на ошибку счета. Эта модель рассматривает частицы и клетки отдельно. Предположим, у нас есть p частиц в n клетках. Затем мы можем записать следующие дифференциальные уравнения для описания динамики частиц и клеток:
В приведенных выше уравнениях K расщепление - это скорость, с которой частицы расщепляются, K fp - это скорость, с которой частицы образуются в отсутствие индукции, τ p - обратная величина скорости распада частиц, μ B - скорость роста ярких частиц. клеток, а µ D - скорость роста темных клеток. Диаграмму реакции смотрите Дополнительный Рис. 3 ,
В модели мы предполагаем, что на клетку может быть только одна частица. Следовательно, есть p- клетки, которые содержат частицы, и n- p, которые не содержат частиц. Мы обозначаем их как «светлые» и «темные» клетки соответственно. Используя модель, мы можем рассчитать (1) динамический диапазон DCDC, (2) влияние неравных скоростей роста между яркими и темными ячейками и (3) относительный вклад расщепления частиц, деградации и ложного образования во времени.
Для того чтобы счет функционировал, мы должны разделить временные рамки между частицами и клетками. Если клеточная динамика не происходит быстрее, чем динамика частиц, то соотношение частиц к клеткам будет отражать производство, деградацию или расщепление частиц, а не рост и деление популяции измеряемых клеток. Другими словами, клетки должны расти намного быстрее, чем чистая продукция (или распад) частиц. Основываясь на наших экспериментах с покадровой микроскопией и турбидостатом, мы обнаружили, что частицы стабильны в течение нескольких дней и что их производство намного медленнее, чем деление клеток. Таким образом, мы можем с уверенностью предположить, что как 
, 
,
(1) Чтобы определить динамический диапазон, мы рассчитываем установившееся отношение pf p / n, когда время переходит в бесконечность. Для начала нормализуем время относительно скорости роста темных клеток
Там, где звездочки указывают, что константы скорости нормализованы на деление (или на поколение). Сначала рассмотрим случай, когда 
, В этом случае n будет расти экспоненциально, а p будет оставаться постоянным как 
, Таким образом, соотношение 
как 
в этом случае. Более интересный случай, когда 
, Совершенно очевидно, что 
потому что n > p . Таким образом, как 
и р и п уйдут в бесконечность. Поскольку нас интересует соотношение p / n , мы можем использовать правило Л'Оспиталя:
Мы знаем, что в устойчивом состоянии 
обычно, по крайней мере, в 100 раз, таким образом, мы можем упростить, разделив все на n :
Таким образом, динамический диапазон DCDC полностью ограничен ложной производительностью.
(2) Если мы нормализуем dn / dt так, чтобы мы смотрели на относительный рост населения, мы видим, что
Существует тривиальное решение, где 
и тогда ничего не растет. Иначе, это описывает экспоненциальный спад к 1 (так как в конечном счете 
), что является скоростью роста темных клеток. Таким образом, даже если есть начальная разница между скоростью роста ярких и темных клеток, она быстро исправится со временем.
(3) Это похоже на (2), но с уравнением dp / dt:
И мы можем видеть, что расщепление и деградация экспоненциально уменьшаются по важности с течением времени, в то время как ложное производство асимптотически увеличивается к своему максимальному значению K fp для 
,
Моделирование динамики популяции микробиоты
Мы рассмотрели в общей сложности семь случаев в нашей модели. Ниже мы показываем уравнения, используемые для описания динамики населения в каждом из этих случаев:
Здесь G - экспоненциальная скорость роста, R - скорость удаления, D - смертность, g - логистическая скорость роста, c - пропускная способность, G x и G y - логистическая скорость роста видов x и видов y. соответственно, k p - сила взаимодействия между видами x и y , ( d max + 1) d min - максимальная смертность, τ D - скорость, с которой смертность уменьшается в сторону стационарной смертности, d min - уровень смертности в стационарном состоянии, r - уровень физиологического удаления, k I - уровень иммунного ответа, c I - максимальный уровень иммунного ответа, k B - уровень бактериофаговой инфекции, а k BS - размер всплеска бактериофаг. Мы обозначаем интересующую бактерию, используя x , другие виды как y , силу иммунного ответа, используя I , и бактериофаги, используя B. Мы не включили отдельный термин смерти в случае «взаимодействия с другими бактериями» ( Рис. 5с ) как в этом случае смерть опосредуется взаимодействием с другими бактериями.
Для участков в Рис. 5а мы использовали G = 1/3 ч -1, R = 1/6 ч -1 и варьировали D от 0 до 1/3 ч -1. Для участков в Рис. 5б мы использовали g = 1/3 ч -1, R = 1/6 ч -1, с = 1 и варьировали D от 0 до 1/3 ч -1. Для участков в Рис. 5с , мы использовали G x = 1/3 ч -1, G y = ½ ч -1, R = 1/6 ч -1 и варьировали k p от -1 до 1. Для графиков в Рис. 5г мы использовали g = 1/3 ч-1, R = 1/6 ч-1, d max = 30, τ D = 0,5 и варьировали d min от 0 до 1/3 ч-1. Для участков в Дополнительный рис. 6а мы использовали G = 1/3 ч -1 r = 1/3 и меняли D от 0 до 1/3 ч -1. Для участков в Дополнительный рис. 6б мы использовали G = 1/3 ч-1, R = 1/6 ч-1 и c I = 1, и меняли k I от 0 до 1. Для графиков в Дополнительный рис. 6в мы использовали G = 1/3 ч -1, R = 1/6 ч -1, k BS = 50 и варьировали k B от 0 до 1.
Простые случаи (отсутствие обратной связи, ограничение питательных веществ и физиологическое удаление) были решены аналитически с использованием функции DSolve в Mathematica 10.2. Все остальные случаи были решены численно с использованием MATLAB.
